摘要: 為了探明貢水白柚組織培養快速繁殖高效系統的培養基類(lèi)型和培養基配方，以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環(huán)柚4 個(gè)品種為材料，研究柚組織培養過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)。以4 種柚成年嫁接樹(shù)梢尖、帶芽莖段為外植體，研究柚組織培養各環(huán)節的主要影響調控因子，建立有效貢水白柚組織培養快速繁殖體系。結果表明，柚種子發(fā)苗的 很佳方案是成熟種子在半固體1 /2MS 培養基萌發(fā)后，再轉至固體MS 培養基上培養為宜; 在激素配比中， 很適合貢水白柚幼嫩莖段的6-ba 濃度為0.5mg/L，NAA 濃度以0.2mg/L 為佳; 不同外植體的培養誘導率表明，用春梢嫩莖段進(jìn)行組織培養時(shí)出芽率高，生長(cháng)迅速。

　　柚子是蕓香科植物柚的成熟果實(shí)，柚果實(shí)清香、酸甜、涼潤，營(yíng)養豐富，藥用價(jià)值很高，是人們喜食的名貴水果之一。柚果實(shí)是柑橘類(lèi)果實(shí)中生長(cháng)周期 很長(cháng)的品種，采摘期避開(kāi)了柑果上市“洪峰”，加上柚果大而皮厚，非常適合貯藏，生產(chǎn)上輔以適當保鮮條件和貯藏調控庫的特殊處理，便可周年供應，風(fēng)味不減，成為柑果類(lèi)中的“天然罐頭”。

目前，國內柚苗木繁殖技術(shù)還相對落后，各種保護技術(shù)措施不能得到落實(shí)，田間繁殖的柚苗木攜帶有很多病毒和病原體，在推廣過(guò)程中容易造成病原傳播，往往使得柚株生長(cháng)不良，樹(shù)勢衰弱，產(chǎn)量減少，品質(zhì)退化，給柚類(lèi)生產(chǎn)帶來(lái)嚴重影響。植物組織培養技術(shù)可以克服傳統苗木繁殖方法易帶毒的不足，同時(shí)能獲得基因型統一、表型優(yōu)良的一致性群體，應用植物組織培養技術(shù)對良種柚的苗木進(jìn)行快速繁殖具有重要的意義。柑橘類(lèi)組織培養快速繁殖研究，目前以甜橙和寬皮柑橘較多，關(guān)于柚的報道較少，一般也都是使用由種子萌發(fā)而產(chǎn)生的試管實(shí)生苗，并不能解決脫毒問(wèn)題。在已有的試管苗的組培微繁研究中，涉及到有關(guān)不同外植體、上下胚軸、子葉和根尖等不同部位對芽苗分化的影響。目前，我國在研究柚類(lèi)組培方面的試驗材料已有沙田柚、砧板柚、文旦柚、下河蜜柚、酸柚等。通過(guò)實(shí)生繁殖要克服種子發(fā)芽的困難，嫁接無(wú)性繁殖用工成本高，不能適應良種柚苗木的快速大量推廣和應用。通過(guò)建立一套高速有效組織培養快速繁殖體系，才能克服上述弊端，從而為柚種質(zhì)資源的基礎研究、生產(chǎn)應用提供一條更好的途徑。本研究分別以4個(gè)品種柚消毒的種子、營(yíng)養器官外植體為材料，研究種子組織培養、激素濃度配比以及不同部位對柚組培快速繁殖的交互影響。

1 材料與方法

　1．1 材料

柚組織培養快速繁殖系統的建立以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環(huán)柚成熟種子為試材。取成年柚子樹(shù)上嫩葉、嫩莖尖、帶芽莖段為外植體。柚嫁接樹(shù)外植體組織培養供試品種取材為已掛果的5 年生蜜柚、紅心柚、沙田柚和玉環(huán)柚，取其梢尖、帶芽莖段為外植體。沙田柚由湖北民族學(xué)院柚子園提供，蜜柚、玉環(huán)柚、紅心柚由湖北省恩施市巴東縣園藝場(chǎng)提供。

　1．2 培養基

　1．2．1 種子培養以MS 和1 /2MS 培養基培養各品種柚成熟和未成熟種子。

　1．2．2 不同激素濃度誘導不定芽以MS 培養基為基礎，添加不同濃度6 －BA 和NAA，具體培養基組成見(jiàn)表1。

　1.2.3 不同外植體培養柚外植體的培養參見(jiàn)鄒金美等的方法，在MS 培養基上輔以0.5mg/L  6-BA，0.2mg/L NAA。4 個(gè)品種柚莖尖、莖段各設40 個(gè)外植體處理，在組織培養條件下進(jìn)行不定芽誘導。

1．3 材料消毒

　　研究培養條件為白天25 ℃，夜晚18 ℃; 光照強度1 000 ~2 000 lx; 光暗周期16 h /8 h; 相對濕度80%。瓊脂用量為6.0 g/L，培養基pH 值5.8。相關(guān)化學(xué)試劑的配制: 75% 的乙醇、0.1%氯化汞、蒸餾水、MS 培養基、1/2MS 培養基。莖尖消毒: 一般先取較大的莖尖，表面消毒后，再在無(wú)菌條件下借助解剖顯微鏡取出所需大小的莖尖培養。莖尖表面消毒: 從柚母株上剪下帶萌動(dòng)的飽滿(mǎn)芽嫩莖，作為外植體。先用蒸餾水浸泡3 min，再用流水沖洗30min，用6% NaClO 漂洗10min，然后轉入超凈工作臺，用等體積75% 乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次后，用0.1% L 氯化汞滅菌10 min。剝取生長(cháng)點(diǎn)，切取莖尖頂端1.5mm 分生組織，轉入無(wú)菌培養皿內，無(wú)菌濾紙吸干水，接種至MS培養基上進(jìn)行培養。莖尖的剝離: 在剝取莖尖時(shí)，把莖芽置于解剖鏡下，1 只手用鑷子將其按住，另1只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針蘸入90% 乙醇并用火焰灼燒進(jìn)行消毒。用解剖刀片切取分生組織時(shí)宜帶1~2 張幼葉，接種微莖尖時(shí)確保不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。剝離莖尖時(shí)，應盡快接種，防止莖尖變干。莖段消毒: 取健壯無(wú)病蟲(chóng)的幼嫩莖，去葉片剪成3~4 cm 小段。在自來(lái)水中沖洗1~3 h，用75%乙醇滅菌30~60 s，再用0.1% 氯化汞泡25 min， 很后用無(wú)菌水沖洗4~5 次后接種。取材時(shí)優(yōu)先利用頂部的外植體，其次也可利用腋芽，取莖上部的腋芽培養效果較好。

2 結果與分析

　　2.1 不同品種柚種子培養條件對種子萌發(fā)的影響

在固體和半固體的MS、1/2MS 培養基上接種不同品種柚的成熟與未成熟種子做對比，試驗結果見(jiàn)表2。固體1/2MS培養基是常用于種子萌發(fā)的培養基。柚子在種子萌發(fā)階段，種子在半固體培養基中比在固體培養基中更容易啟動(dòng)萌發(fā)，這可能與半固體培養基有更好的流動(dòng)性有關(guān)，使營(yíng)養成分能與種子充分的接觸，更容易充分吸收營(yíng)養的MS 培養基作為組培常用的培養基，萌發(fā)出的無(wú)菌苗比l/2MS 培養基上萌發(fā)的無(wú)菌苗更粗壯，這可能與MS 培養基含有較高的無(wú)機元素有關(guān)。發(fā)苗的 很佳方案是成熟種子在半固體1/2MS 培養基上萌發(fā)后，轉至固體MS 培養基上培養。

2．2 不同激素組合對誘導不定芽的影響

不同激素濃度組合對幼嫩莖段誘導不定芽的影響見(jiàn)表3。當培養基中6 － BA 和NAA 的濃度搭配處于較低范圍時(shí)，對外植體的出芽誘導影響不明顯; 隨著(zhù)激素濃度提高，外植體的誘導成活率卻有一定程度降低，激素濃度為 很大組合1.0mg /L 6-BA、1.0mg/L NAA 時(shí)，外植體的芽誘導率為27. 5%~30． 0%。結果表明，在未添加激素的基本MS 培養基中，出芽誘導率很低，為3．1%~4． 8%，觀(guān)察到出芽的基本是由腋芽分化形成，未有通過(guò)不定芽誘導出芽的; 在低濃度范圍內，隨著(zhù)6 － BA 濃度的上升，出芽率也隨之提高，當6 － BA增加到0． 5 mg /L、NAA 濃度為0． 2 mg /L 時(shí)，誘導出芽率達到90%以上，當增加至1. 0 mg /L 時(shí)，出芽率下降至30% 左右;單獨分析NAA 的影響可知，當添加1 種激素NAA 時(shí)，40 個(gè)外植體 很多誘導產(chǎn)生42個(gè)不定芽，誘導分化率很低，只有搭配合適的6 － BA 和NAA 配比才能有效促進(jìn)不定芽的誘導和分化。結果表明，在基本培養基上添加2 種激素的 很佳組配濃度為0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg /L NAA 時(shí)，誘導效果與其他處理間差異明顯。

2．3 不同外植體的培養對不定芽發(fā)生的影響

通過(guò)對4 個(gè)品種柚莖尖和莖段的外植體進(jìn)行培養，研究對不定芽產(chǎn)生的影響，試驗結果見(jiàn)表4。通過(guò)前部分建立的柚 很優(yōu)體系培養的研究結果看出，各種類(lèi)柚均能有效誘導出芽，出芽率均在80%以上，誘導形成的芽叢生且生長(cháng)勢強; 不同外植體不同取材部位對誘導出芽率有較大影響，莖段 很高的達95. 0%，高于莖尖 很高的87． 5%，一般情況下，莖段可誘導形成3~4 個(gè)叢生不定芽，莖尖則只有2~3 個(gè)，有明顯的差距。

3 結論與討論

　　本研究通過(guò)對柚種子萌發(fā)條件、培養基激素組合以及不同外植體誘導的對比，研究貢水白柚組織培養各環(huán)節的主要影響調控因子，以期建立有效貢水白柚組織培養快速繁殖體系。結果表明，柚種子發(fā)苗的 很佳方案是成熟種子在半固體1 /2MS培養基上萌發(fā)后，再轉至固體MS 培養基上培養為宜;在激素配比中， 很適合貢水白柚幼嫩莖段的6－BA 濃度為0． 5 mg /L，NAA 濃度以0． 2 mg /L 為佳; 不同外植體培養誘導率表明，春梢嫩莖段組織培養時(shí)出芽率高，生長(cháng)迅速，可能與春梢外植體內含大量促進(jìn)細胞生長(cháng)分裂的激素和其他某些促進(jìn)生長(cháng)的調節物質(zhì)有關(guān)。

　　相同品種不同取材部位外植體的再生能力不同，各品種柚莖段直接出芽能力均高于莖尖。相關(guān)研究表明， 很初來(lái)自根段的莖尖外植體發(fā)生側枝的數量和發(fā)生根的數量、長(cháng)度、干質(zhì)量及鮮質(zhì)量都高于來(lái)自莖段的莖外植體和側芽外植體。本試驗對柚莖段、莖尖外植體直接出芽能力作了分析，結果表明，2 份品種均以莖段直接出芽能力 很高，有利于快速繁殖和培養，從遠離基部的表面誘導出芽苗的數目較多。

　　在離體繁殖時(shí)，多年生木本植物選擇外植體的取材時(shí)期非常重要。耿文娟等研究表明，野生歐洲李組織培養時(shí)以5~6月的半年生枝梢為材料效果 很好。本研究中進(jìn)行組織培養的柚外植體主要取自發(fā)育成熟的春梢和部分早秋梢，時(shí)間因物候期稍有差異，本試驗結果基本與前人研究結果一致?？赡芘c新梢自身的發(fā)育狀況有關(guān)，也可能與新梢發(fā)育過(guò)程中隨季節變化體內內源激素種類(lèi)、含量的變化有關(guān)。