麗格海棠( Begonia elalior) 為秋海棠科秋海棠屬多年生草本花卉，為球根海棠和野生秋海棠雜交選育而成。其花期長(cháng)、花朵大、花色豐富、鮮艷，深受消費者的歡迎，多用于家庭幾案、桌飾、窗飾、賓館大堂、客廳、餐廳和會(huì )議室擺放，是冬春季節美化室內環(huán)境的重要花卉。麗格海棠通常無(wú)種子，一般采用扦插、組織培養進(jìn)行繁殖。扦插繁殖主要以莖插和葉插為主，但繁殖速度慢，且非常容易爛根，很難滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。筆者采用麗格海棠不同部位，對其進(jìn)行叢生芽誘導、繼代增殖和生根培養比較研究，以建立一套完整的組織培養體系。

1 材料與方法

　　1.1試驗材料供試材料為盆栽麗格海棠。

　　1.2試驗方法

　　1.2.1培養基的配制。

采用MS 培養基，pH 5.8，在121~126 ℃滅菌15－20 min。蔗糖30 g /L，卡拉膠9.0 g /L。

誘導培養基: MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L +NAA 0.1mg/L; MS+ 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L; MS + 6-BA 1.0mg/L + 2，4-D 0.2mg /L; MS + 6-PA 1.0mg /L + NAA 0.2mg/L; MS + 6-BA1.5mg/L + NAA 0.2mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg /L; MS + 6-BA 1.5mg/L + 2-4，D 0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg /L + NAA 0.8mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L + 2-4，D 0.1mg /L + NAA 0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.6mg /L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L; MS + 6-BA 0.5mg /L + NAA 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 0.3mg/L+ NAA 0.4mg/L; MS + 6-BA 0.8mg/L + NAA 0.4mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L + 2，4-D0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + 2，4-D 0.1mg/L。

繼代培養基: MS + 6-BA 1.0mg/L +IBA 0.2mg/L; MS+6-BA 1.0mg/L + IBA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L。

壯苗培養基: 以繼代配方為基礎，大量元素減半，糖類(lèi)減半，不添加激素。

生根培養基: 1 /2MS + IBA 0.1mg/L +NAA 0.1mg/L;1/2MS + NAA 0.3mg/L; 1 /2MS + NAA 0.6mg/L; 3 /4MS +IBA 0.3mg/L + KT 0.15mg/L。

1.2.2培養條件。溫度22－26 ℃，光照強度1 200－1 500lx，光照周期12－14 h /d。

　　1.2.3外植體的消毒及處理　取麗格海棠的成熟和幼嫩葉片、葉柄、莖段，將外植體放置于密封培養瓶中，在4 ℃的冰箱中冷藏12－24 h 備用，將處理后的材料中放于少量洗衣液(0.5%) 的水中浸泡并搖勻， 30 s 后把浸泡液倒掉，放于流水下沖洗10 min。在超凈工作臺上先用2%次氯酸鈉浸泡搖勻8~10 min( 葉片8 min; 其余外植體10min) ， 很后用無(wú)菌水沖洗4 次，每次3min 左右。再用0.1%升汞浸泡搖勻消毒8~10 min，將消毒好的外植體置于經(jīng)過(guò)高溫滅菌后的無(wú)菌水空瓶中并蓋好蓋子，接種時(shí)先用消毒后的鑷子夾出放在經(jīng)高溫滅菌的牛皮紙上，然后用消毒過(guò)的解剖刀或刀片對外植體進(jìn)行切割，葉片切成1 cm2 左右大小，葉柄、莖段切成1 cm左右，接種于培養基上。

外植體培養30 和60 d 后分別統計死亡率和分化率。污染率= 污染數/接種總數× 100%。死亡率= 死亡外植體數/有效外植體總數( 即接種數－ 污染數) × 100%。分化率= 分化外植體數/有效外植體總數× 100%。

1.2.4不同外植體分化情況比較。選取麗格海棠的葉片、葉柄、莖段( 有葉腋生長(cháng)點(diǎn)) 為外植體，觀(guān)察統計污染率、死亡率和分化率。

1.2.5繼代培養。取誘導分化出的叢生芽，接種到培養基上，每瓶接種3－4 團叢生芽，然后放入培養室中培養， 30 d后觀(guān)察其繼代生長(cháng)情況。

　　1.2.6壯苗培養。將符合壯苗的小型繼代苗植株，按無(wú)菌操作要求接種到壯苗配方培養基上，每瓶3－5 個(gè)小植株苗，然后放入培養室中培養， 30 d 后觀(guān)察其生長(cháng)情況。

　　1.2.7生根培養。選擇生長(cháng)健壯且高3－5 cm的增殖苗，將其分成單苗接入生根培養基中進(jìn)行生根培養， 30 d 后調查其生根率和根系生長(cháng)狀況。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對外植體愈傷組織形成與分化的影響　由表1可知，綜合考慮葉片培養污染率、60 d 死亡率和60 d 分化率，葉片適宜培養基為MS +6-BA 1.0mg/L + NAA 0.2mg/L +腺嘌呤8mg/L，雖然其分化率只有34.8%，但由于污染率低，總體表現 很好; 葉柄適宜培養基為MS +6-BA 0.5mg/L +NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L，此培養條件下污染率為20.0%， 60d 死亡率和60d 分化率分別達到33.3%和66.7%; 莖段適宜培養基為MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L + 2，4-D 0.1mg /L。一般30 d 分化率高的60d 分化率也較高，但葉柄培養基MS +6-BA 0.5mg/L + NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L， 30d分化率只有8.3%，而60 d 分化率卻達到66.7%。綜合來(lái)看，適宜葉片分化的激素配比為MS + 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L，適宜葉柄分化的激素配比為MS +6-BA0.5mg/L + NAA 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L，適宜莖段分化的激素配比為MS +6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L +2， 4-D 0.1mg /L。

　　同時(shí)，由于葉片在培養過(guò)程中，污染率相對較低，整體分化率相對較高更適宜應用于離體培養。

　　葉片誘導形成愈傷組織的情況見(jiàn)圖1，莖段和葉柄誘導產(chǎn)生芽和愈傷組織的情況見(jiàn)圖2。

　　2.2繼代培養　將誘導培養的芽苗切割后轉入增殖培養基中，培養30 d 后的增殖結果表明，MS + 6-BA 1.0mg/L + IBA0.2mg/L 培養基30 d 后新的叢芽長(cháng)高長(cháng)大，葉子膨脹，苗莖長(cháng)高變粗，形成小植株，生長(cháng)狀況旺盛( 圖3a) 。雖然MS+ 6-BA 1.0mg/L + IBA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L 培養基也有部分開(kāi)始長(cháng)出新的叢芽，但叢芽不明顯，局部發(fā)黃，呈玻璃化現象( 圖3b) ，因此，在后期的壯苗培養過(guò)程中，以此培養基作為壯苗培養的基礎培養基。

　　2.3 壯苗培養　30 d 后壯苗結果( 圖3c) 表明，經(jīng)過(guò)壯苗，植株明顯變得更加粗壯，為生根培養奠定基礎。

2.4 生根培養　由表2可知，不同培養基都可以誘導生根，NAA 濃度過(guò)高時(shí)，根較細長(cháng)，降低NAA 濃度，添加6-BA 時(shí)，根系生長(cháng)茂密、粗壯，因此，誘導麗格海棠瓶苗生根較為理想的培養基為1/2MS +6-BA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L( 圖3d、e、f) 。

3 結論與討論

　　在組織培養中，生長(cháng)素能引起完整組織中細胞擴展，其生理作用是促進(jìn)細胞和器官的伸長(cháng)和細胞分裂，4℃的低溫預處理有利于葉片、葉柄和莖段外植體的誘導培養。不同外植體其分化途徑不同，葉片和葉柄經(jīng)愈傷組織誘導成芽，莖段則可直接進(jìn)行芽的誘導，雖然縮短了培養時(shí)間，但愈傷組織誘導的叢生芽較多。如將莖段和葉柄進(jìn)行4 ℃下冷藏48h 前處理，莖段和葉柄在初代培養中液體溢出量少，污染率和死亡率低，且分化出芽所需時(shí)間短，可能因為低溫處理時(shí)，一方面低溫可能在一定程度上抑制微生物的生長(cháng)，另一方面，在冷藏階段，莖或葉柄切段的分泌物己有部分外滲，因而培養階段分泌物量減少，對外植體的浸泡及毒害作用也就減輕，從而降低了初代培養的死亡率和污染率，大大提高了組培效率。

　　初代培養的目的是建立無(wú)菌的植物組織培養離體生長(cháng)體系，因此其成功與否是組織培養能否進(jìn)行的關(guān)鍵環(huán)節。由于受植物遺傳特性、生理生態(tài)特性及外界環(huán)境條件等的影響，不同植物啟動(dòng)其離體器官或組織脫分化，進(jìn)而再分化建立組織培養無(wú)性系所需的條件不同。全能性是任何植物活細胞都具有的一個(gè)特性，但在一個(gè)物種中可能并非所有的品種，在一個(gè)屬中也可能并非所有的種都能同樣地表達這個(gè)特性。在由同一個(gè)植株切取的外植體中，全能性的表達與否還可能因外植體的生理狀態(tài)而不同。在快速繁殖中，重要的是選擇 很佳狀態(tài)的組織或器官，且這些組織或器官能夠盡快誘導形態(tài)發(fā)生，這是實(shí)現快速繁殖的關(guān)鍵。秋海棠屬植物組織培養中，葉片、葉柄、花梗、花瓣以及嫩莖均可作為離體培養對象，但 很常用的外植體類(lèi)型是葉片和葉柄，因為葉片和葉柄資源豐富，取材容易。四季秋海棠、鐵十字秋海棠、蓮葉秋海棠、突脈秋海棠均有以葉片作為外植體進(jìn)行離體培養的報道; 蟆葉秋海棠及其雜種的組織培養中，絕大多數以葉柄作為外植體，其次是葉片；而球根秋海棠和麗格海棠雜種群，多以葉片作為外植體實(shí)現植株再生，其次是葉柄。鐘十傳等研究表明，秋海棠屬植物中的球根秋海棠“金正日花”組織培養中嫩葉是適宜的外植體類(lèi)型。陳瓊珍等在鐵十字秋海棠組培快速繁殖研究中，采用卷成漏斗狀尚未展開(kāi)的嫩葉作為離體培養的外植體，啟動(dòng)培養效果好。但該試驗中，中度成熟器官無(wú)論從成活率還是分化率上均優(yōu)于幼嫩器官，因為后者在表面消毒過(guò)程中極易死亡，從而初代培養成功率很低。秋海棠屬植物組織培養中以莖段作為外植體的報道較少，可能是莖段含水量較高不易成活。

　　該研究對葉、葉柄和莖段外植體的死亡情況和分化情況進(jìn)行比較表明，經(jīng)愈傷組織誘導途徑的誘導系數遠大于直接芽誘導途徑，但愈傷組織誘導途徑誘導時(shí)間較長(cháng)，一般為20-60 d，芽誘導途徑較快， 20 d 左右分化。莖段作為外植體進(jìn)行離體培養時(shí)，可不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段直接誘導出芽，其分化出芽所需時(shí)間短，約20 d 即開(kāi)始分化，芽色嫩綠; 而葉片、葉柄和莖段誘導形成愈傷組織的時(shí)間約50 d，雖然反應時(shí)間慢，但產(chǎn)生的愈傷組織團多，誘導叢生芽的數量也多，生長(cháng)狀況更加良好。

　　該試驗通過(guò)對麗格海棠葉片、葉柄和莖段離體培養技術(shù)的研究，建立了一套較完善的組培快繁體系。MS + 6-BA 1.0mg /L + 2，4-D 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L是誘導葉片愈傷組織培養的 很佳激素配比; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L 是誘導葉柄和愈傷組織培養的 很佳激素配比，2，4-D 在麗格海棠組織培養過(guò)程中，能夠很好地促進(jìn)愈傷組織的形成; MS + 6-BA 0.5mg/L +NAA 0.4mg/L + 2，4-D0.1mg/L 是誘導莖段愈傷組織的 很佳激素配比; MS + 6-BA 1.0mg/L + IBA 0.2mg/L 是繼代培養的 很佳激素配比，1 /2MS + IBA 0.1mg/L +NAA 0.1mg/L 是生根培養的 很佳激素配比。該研究為麗格海棠工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據。