甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是小型多年生菊科（Compositae）宿根性草本植物，原產(chǎn)于南美洲巴拉圭高原，幾個(gè)世紀以來(lái)甜葉菊一直被巴拉圭的印第安人作為甜味飲料飲用。日本1970 年從巴西開(kāi)始引入甜葉菊，并栽培馴化，同時(shí)進(jìn)行食品、毒理檢測等試驗，并 研發(fā)利用甜菊糖苷。中國在1976—1977 年間從日本成功引種甜葉菊，于1979 年提取出了甜菊糖甙/苷（Stevioside），并在食品罐頭中成功試用；山東科技報2013 年5 月29 日報道：“中國已是全球 很大的甜葉菊生產(chǎn)國和出口國，約占世界市場(chǎng)的90%，現在茶用甜葉菊市場(chǎng)需求量大增，產(chǎn)品供不應求”。甜菊糖苷是一種 好的天然甜味劑，因其具有低熱高甜、安全無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，而備受肥胖癥、糖尿病患者的歡迎；甜菊糖苷具有明顯的降壓作用，有望成為高血壓藥物的替換或輔助藥物。甜菊糖苷在東南亞、南美洲及遠東地區，已廣泛應用于醫藥和食品領(lǐng)域。

　　甜葉菊的生殖特點(diǎn)為：自交不育、異花授粉，遺傳穩定性差；甜葉菊在0℃以下不能越冬，且種子發(fā)芽率低，目前僅靠種子繁殖遠不能滿(mǎn)足世界甜葉菊市場(chǎng)的需求。因此科技人員期待利用組織培養技術(shù)來(lái)大量生產(chǎn)遺傳穩定、品質(zhì)良好的甜葉菊。采用組培技術(shù)不僅能保持高品質(zhì)甜葉菊品種的優(yōu)良特性，在較短時(shí)間內，培育出大批種苗，還可不受外界條件的影響周年繁殖；將組培技術(shù)應用于甜葉菊的生產(chǎn)還將推動(dòng)甜葉菊的遺傳改良，從多方面彌補甜葉菊傳統育種的不足。因此組織培養技術(shù)對甜葉菊的快速繁殖具有很高的經(jīng)濟價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。近幾十年來(lái)國內外已有一些關(guān)于甜葉菊組織培養的報道，筆者對其進(jìn)行綜述，旨在探討今后的研究方向，為進(jìn)一步選育產(chǎn)量高、糖苷含量高的優(yōu)良品系奠定基礎，為甜葉菊的資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 外植體及其培養

　1.1外植體的選擇與滅菌

　　1.1.1外植體的選擇在甜葉菊組織培養中，選擇外植體是非常重要的一環(huán)，取材部位不同，培養結果就會(huì )不同。臧淑英等采用1.5mm左右的莖節間部分切段為外植體，成功地從莖段愈傷組織再分化出了植株，但分化頻率不高，只有20%~60%。沈秀麗等研究發(fā)現與葉柄、葉片、莖段、下胚軸相比，以莖尖為外植體進(jìn)行甜葉菊的組織培養，無(wú)論愈傷組織誘導率還是出芽率都較為理想。婁玉霞等采用葉片為外植體，建立了甜葉菊葉片愈傷組織高效不定芽的分化和植株再生體系，離體葉片愈傷組織誘導率和不定芽分化頻率均可達100%。黃蘇珍等采用嫩莖和葉柄為外植體進(jìn)行了甜葉菊“中山一號”快速繁殖的研究，結果表明：采用頂芽或葉柄作為外植體均能形成愈傷組織，并誘導分化出不定芽，不定芽誘導率達85%。C. M. Ferreira 等先以甜葉菊葉盤(pán)為外植體獲得松散的愈傷組織，再以此愈傷組織作為初始接種物，成功地進(jìn)行了細胞的懸浮培養及離體保存。在進(jìn)行甜葉菊組織培養時(shí)，要依據實(shí)驗目的，選擇 很適的外植體，如僅為了收獲愈傷組織，則莖節、莖段、葉片都是較為合適的材料；要收獲大批的組培苗則莖尖是較為合適的材料。

　　1.1.2外植體的消毒甜葉菊外植體的消毒，大多采用濃度為0.1%的HgCl2配合70%-75%的酒精。沈秀麗等認為：用70%的酒精將種子浸泡20s，再用0.1%的升汞消毒10min，然后用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，就能達到理想的滅菌效果。黃蘇珍等采用甜葉菊葉柄或頂芽為外植體，消毒順序為：先用自來(lái)水沖洗，除去附著(zhù)在材料表面的泥沙等雜質(zhì)，再用10%的洗衣粉浸泡5min，70%酒精消毒2min，0.1% HgCl2消毒5min，無(wú)菌水沖洗3-5 次，消毒效果較為理想。但臧淑英等將甜葉菊植株頂梢，經(jīng)75%酒精表面消毒30s，再用飽和漂白粉上清液表面消毒15min 后，用無(wú)菌水沖洗3-4 次；Claudio 等先將幼葉用流水沖洗，然后用0.5%次氯酸鈉浸泡10min， 很后用滅菌水沖洗干凈；Hemant 等將外植體用0.5%的次氯酸鈉或體積比為15%的漂白劑和0.1%的吐溫20 消毒20min，接種前5 min 用無(wú)菌水沖洗3 次，都可達到滅菌效果。

　1.2培養條件及基本培養基的選擇

　　1.2.1培養條件目前甜葉菊組織培養，普遍采用的培養條件為：pH 值5.5-5.8，光照時(shí)間12-24h/d，光照強度600-3000lx，相對濕度60%-70%，溫度23-28℃。

　　1.2.2基本培養基甜葉菊組織培養，國內外主要采用1/4 MS、1/2 MS、MS 等基本培養基，其中愈傷組織的誘導及繼代增殖主要用MS，生根培養主要用1/4 MS 或1/2MS。但也有以添加LS 的大量元素和微量元素及Nitsch 中的維生素的培養基或B5 培養基對甜葉菊進(jìn)行組織培養的。婁玉霞等在White 基本培養基上誘導不定芽生根，生根率達100%。針對不同的需要，可以改變基本培養基中的營(yíng)養成分及其含量。沈秀麗等研究表明：以MS為基本培養基進(jìn)行甜葉菊組織培養，培養物生長(cháng)速度快，分化頻率高；以蔗糖作碳源的培養物，其愈傷組織誘導率、出芽率均比葡萄糖、麥芽糖作碳源的高。Shireen 等比較了葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源時(shí)對腋芽和莖尖誘導率的影響，確定了適于不定芽誘導的碳源為蔗糖和葡萄糖。Nikolai 等研究卻表明：在MS 培養基中添加果糖或葡萄糖，芽的生長(cháng)發(fā)育要優(yōu)于附加蔗糖的培養基，但在添加果糖或葡萄糖時(shí)，葉片中干物質(zhì)的量及甜菊糖苷含量都會(huì )下降，3%的蔗糖添加量，甜菊糖苷含量 很佳。赫福霞、董振紅等除了以添加3%蔗糖的1/4 MS 為基本生根培養基外，還添加了0.1%的活性炭。

2 不同激素及其組合對組織培養的影響

　2.1不同激素及其組合對愈傷組織誘導的影響

　　誘導愈傷組織時(shí)需要添加生長(cháng)素和細胞分裂素，至于使用量以及如何配合使用，不同的品種、不同的材料和不同的研究者的結論不同。臧淑英等采用莖段為外植體，MS 培養基中單獨添加一種生長(cháng)素：0.2 mg/L 的2，4-D 或0.5 mg/L 的NAA， 愈傷組織誘導率分別為76%和88%，基本培養基中不添加激素或單獨添加一種BA，都不能形成愈傷組織；細胞分裂素和生長(cháng)素配合使用，愈傷組織的誘導率將會(huì )提高：接種在MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.2（或1.0）mg/L 或MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L 上的莖段，愈傷組織誘導率都可達100%，但隨著(zhù)BA 濃度的提高，愈傷組織誘導率卻呈顯著(zhù)下降趨勢，如：接種在MS+NAA 0.5mg/L+BA 5.0 mg/L 上的莖段，愈傷組織誘導率僅為53%。婁玉霞等認為： 很適于離體葉片愈傷組織誘導的培養基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5mg/L。Kaye 等在添加2，4-D 0.5 mg/L 的MS 培養基中以葉片為外植體誘導出了胚狀愈傷組織。Mohammed 等以葉片、莖節、莖段為外植體，在MS 培養基中添加2，4-D 3.0 mg/L 均可誘導出 很大量的愈傷組織。陳少瑜等以葉片為外植體，在添加2，4-D 1.0 mg/L、KT0.2 mg/L 及BA 0.5 mg/L 的MS 培養基上誘導出黃色疏松型愈傷組織，在附加BA 2.0 mg/L、IBA 0.5 mg/L 及NAA 0.5 mg/L 的MS 培養基中誘導出的愈傷組織呈綠色且堅硬。倪德祥等發(fā)現高濃度NAA 和低濃度BA 組合時(shí)，愈傷組織較疏松而大；高濃度BA 和低濃度NAA 組合時(shí)，在比較松散呈白色絮狀的愈傷組織上有比較致密的顆粒結構，且能進(jìn)一步誘導出芽。

　　葉軍等在含有0.5-3 mg/L 6-BAP 的培養基中誘導出了愈傷組織。M. B. Tadhani 等在添加2.0 mg/L NAA 和0.3 mg/L 6-BA 的MS 培養基中也誘導出了大量愈傷組織。王凱基等研究表明：生長(cháng)素種類(lèi)對誘發(fā)甜葉菊愈傷組織影響不大，而對愈傷組織的形態(tài)起著(zhù)不同的調節作用。Meenakshi 等將葉片接種在添加不同濃度藍藻混合物的培養基中，誘導愈傷組織的形成，結果表明：5mL/L 和10mL/L 為藍藻的 很佳添加量。

　2.2 不同激素及其組合對芽分化及繼代增殖的影響

由于材料不同，形成完整植株的途徑也就不同，一般而言，植株再生可分為體細胞胚發(fā)生途徑及器官發(fā)生途徑，又根據是否經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，而進(jìn)一步將器官發(fā)生途徑分為器官間接發(fā)生途徑和器官直接發(fā)生途徑，其中間接發(fā)生途徑需經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，通常需要的時(shí)間更長(cháng)。

　　呂榮華等把幼葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織及時(shí)轉到添加1.0mg/L BA 和0.1-0.5 mg/L NAA， 或3mg/L ZT 和0.5mg/L NAA 的MS 培養基中誘導芽的分化。徐惠珠等把愈傷組織轉移到BA 和IAA 比例為0.65∶1-10∶1的分化培養基上后，觀(guān)察發(fā)現愈傷組織顏色逐漸變綠，結構日趨緊密，40-60d 后即可分化出芽。Mitra等將莖段接種在MS+1.0 mg/L IAA +10.0 mg/L KT+30.0mg/L ADS（硫酸腺嘌呤）的培養基中誘導不定芽的分化，4周內出芽率達90%，12 周內平均每個(gè)外植體產(chǎn)芽量大于10。沈秀麗等采用甜葉菊種子萌發(fā)幼苗的莖尖為外植體，發(fā)現在MS+0.5 mg/LNAA+0.5 mg/L BA 中可誘導產(chǎn)生一次性叢生芽。Pourvi 等以莖段和葉片為外植體，在MS+BAP 2.2μM+IAA 2.8μM 的培養基上，也直接誘導產(chǎn)生了不定芽。他們認為在誘導培養基中加入0.5μM CuSO4.5H2O 可顯著(zhù)提高外植體的出芽率，且誘導出的幼苗葉寬大，葉色深綠。

　　Yukiyoshi 等在附加10 mg/L KT 的基本培養基中，以帶葉原基的莖尖為外植體，也直接誘導出了大量叢生芽。Chi 等研究表明：以MS 為基本培養基并添加NAA 0.1 mg/L 時(shí)，附加KT 比附加BA 更有利于甜葉菊莖尖的增殖。Claudio等研究表明：為了連續獲得再生芽，應該在芽長(cháng)至合適的長(cháng)度后及時(shí)轉入含低濃度BA 0.1 mg/L 的繼代培養基中繼代培養。赫福霞等利用正交試驗設計方法探討了植物生長(cháng)物質(zhì)（6-BA、NAA）、蔗糖、水解酪蛋白（CH）對甜葉菊叢生芽誘導的影響，結果表明：蔗糖對叢生芽誘導影響 很大，其次是6-BA、NAA，CH 影響較小，篩選出甜葉菊叢生芽誘導的 很適培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+瓊脂6g/L+蔗糖30g/L； 很佳繼代培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+瓊脂6g/L+蔗糖30g/L。張子學(xué)等研究了不同種類(lèi)、不同濃度的植物生長(cháng)調節劑對甜葉菊繼代苗增殖的影響，結果表明：適宜的繼代增殖培養基為MS+BA 0.4 mg/L+NAA 0.1mg/L， 很高增殖倍數達14.4。劉清波等正交試驗結果表明大量元素濃度對叢生芽的增殖影響 很大，其次是6-BA、蔗糖，NAA 的影響較小。蔡永智等以“守田3 號”甜葉菊葉片為外植體，進(jìn)行再生體系的建立，研究表明： 很佳不定芽繼代培養基為MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.05mg/L NAA＋0.2mg/L GA3＋4.0mg/L KT 。

2.3不同激素及其組合對不定根形成的影響

在1/4 MS、1/2 MS 或MS 的基礎上添加不同濃度的NAA、IAA、IBA 或其組合，是目前 很常見(jiàn)的根分化培養基。黃蘇珍等研究表明：在添加0.1mg/L BA、0.5mg/L IBA 和0.5mg/L NAA 的MS 培養基上，甜葉菊品系“中山一號”生根效果 很好，ZT 卻會(huì )抑制根的形成。Shireen等在附加IAA 或IBA（1-4 mg/L）的MS 培養基中轉入3-125px 長(cháng)的不定芽，移栽后，成活率達95%以上。大部分研究者認為，NAA 對生根有促進(jìn)作用，但也有不同的研究結果，如Nikolai 等研究則表明：BA 強烈抑制根系統的形成，而NAA 對甜葉菊不定根的發(fā)生卻無(wú)影響，GA3利于芽的伸長(cháng)及根的誘導。原因可能是材料不同或者前期使用激素不同所致。

董振紅等研究表明：在1/4 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+活性炭1g/L的培養基上，誘導生根，生根率達100%。Latha 等認為：1/2 MS 中添加IBA 4.90μM比MS 中添加同樣濃度IBA， 誘導不定芽生根效果要好，30d 后，誘導出的根長(cháng)且密，生根率達100%。沈秀麗等把長(cháng)至2-75px 具l-2 對葉的增殖芽，從愈傷組織上切下，接入1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L 的培養基上，1 周左右即可生根，平均每株生根6-10 條，根長(cháng)3-100px。尚宏芹等以甜葉菊組培無(wú)根苗為試驗材料，研究培養基、NAA 濃度及活性炭對甜葉菊生根培養的影響。結果表明：1/2 MS 誘導生根的效果優(yōu)于2 MS、MS 和1/4 MS；0.2 mg/L 的NAA 誘導生根效果 很好，誘導率為83.3%，根粗壯而長(cháng)；0.3%活性炭不但可大大地縮短生根時(shí)間，而且提高了生根率，增加了根數。

3 組培苗的移栽

組培苗移栽是關(guān)系到能否實(shí)現工廠(chǎng)化育苗的關(guān)鍵，目前對甜葉菊組培苗移栽的報道較少。翁曉燕等研究指出：2.5mg/L-10mg/L 濃度的多效唑能有效提高甜葉菊試管苗移栽后的成活率，處理根系比葉面噴施效果更好，其中以5mg/L 濃度在開(kāi)蓋煉苗浸根3d 處理 很為有效，移栽成活率達到92.4%，是對照的2.26 倍。董振紅等摸索出的移栽條件為：待甜葉菊試管苗在培養瓶中培養至長(cháng)有6 片以上葉子和發(fā)達的根系后，可先敞口煉苗2d，再在含1/8 MS+IBA 0.05mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖15g/L 的培養液中浸根2d 后洗凈根部，將苗轉入裝有土沙，并澆少量培養液（1/20 MS）的小花盆中，為了提高莖稈強度，增強抗猝能力，可在沙土中添加少量草木灰，澆足水。如果室外溫度達不到25℃左右，可暫時(shí)將小花盆放入溫度適宜的溫室中，每隔2d 澆1 次水。如室溫適宜，可先放在室內陰涼處，每1-2d 澆1 次水，4-5d 后，如果苗長(cháng)勢良好，則可移入陽(yáng)光下培養。定期澆水，待小苗成活后，溫度適宜時(shí)再移于大田栽培。

4 問(wèn)題與展望

　　在經(jīng)濟植物中占有重要地位的甜葉菊，越來(lái)越受到甜葉菊研究者的青睞，國內外對組織培養甜葉菊的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年，無(wú)論在理論上還是技術(shù)上都取得了長(cháng)足發(fā)展，已經(jīng)初步建立了快繁體系，但商品化生產(chǎn)還有很多問(wèn)題需要解決。鑒于目前組織培養甜葉菊的研究現狀及發(fā)展趨勢，筆者認為應在以下幾個(gè)方面加強研究：⑴完善不同甜葉菊品種的快繁技術(shù)體系，加快優(yōu)良新品種的繁育；⑵開(kāi)展高品質(zhì)甜葉菊種質(zhì)資源的離體保存研究，這將是甜葉菊種質(zhì)資源常規保存的有益補充；⑶將組織培養技術(shù)與基因工程等生物技術(shù)相結合，將抗寒、抗病、抗旱等基因轉移到甜葉菊中， 以期提高抗性； 或與分子生物技術(shù)相結合， 將口感好的Rebaudioside A 合成關(guān)鍵酶基因克隆出來(lái)，轉入具有其它優(yōu)良品質(zhì)的植株中，對甜葉菊進(jìn)行遺傳改良；⑷開(kāi)展原生質(zhì)體培養和體細胞雜交、花粉和花藥培養技術(shù)，為倍性育種奠定基礎；⑸積極開(kāi)發(fā)應用生物反應器直接生產(chǎn)甜菊糖苷的技術(shù)。只有這樣，才能更好地為甜葉菊商業(yè)化生產(chǎn)服務(wù)，才能更好地發(fā)揮組織培養技術(shù)在規模生產(chǎn)上的優(yōu)勢，取得更大的經(jīng)濟效益。